Las proteínas son los principales componentes interferentes no deseados en el análisis cuantitativo de moléculas pequeñas en muestras ex vivo como sangre, semen, suero, orina y líquido cefalorraquídeo. Además, el gran tamaño de la proteína que, también es muy "pegajosa", puede dañar los instrumentos analíticos, especialmente los cromatógrafos, al obstruir los poros de las columnas analíticas.

En Ciencias de la Vida, la cromatografía es el método estándar de separación para los ensayos en los que se requiere un análisis cuantitativo y se puede realizar mediante cromatógrafos de gases o líquidos. Ambos son susceptibles al daños por las moléculas de proteínas. No obstante, también existen otras sustancias que pueden causar bloqueos en las columnas: son los fosfolípidos (PL), un derivado de los ácidos grasos.

Porvair Sciences, fabricante especializado en la producción de microplacas y productos relacionados, ofrece dos tipos de placas filtrantes de 96 pocillos para la precipitación de proteínas de muestras de suero de hasta 2 ml de volumn. El método más simple y rentable es el P3 (placa de precipitación de proteínas), mientras que la microplaca C18 para extracción en fase sólida (SPE) es más sofisticada. La elección de la placa y el método estará determinado por las muestras en uso, el analito deseado y el nivel de sensibilidad requerido.

En general, las muestras procesadas en microplacas P3 son adecuadas para el análisis en las columnas de mayor diámetro de los sistemas de HPLC, mientras que las preparadas en una placa C18 son efectivas en columnas capilares en GC. Los problemas surgen cuando esos dos sistemas se dividen en un espectrómetro de masas.

La LC-MS es una técnica común y la GC-MS de alta resolución se utiliza para analizar los bajos niveles de metabolitos y compuestos de medicamentos en muestras de suero o sangre. Sin embargo, a estos niveles, los fosfolípidos se convierten en un problema mayor y una clase de PL conocidos como lisofosfolípidos (LPL), que no se eliminan con la sílice C18, pueden causar efectos anómalos en las señales GC-MS registradas.

La LPL causa un fenómeno conocido como supresión de la ionización, en el que la alta señal de fondo causada por la LPL enmascara la verdadera señal generada por el analito. Puede aumentar y disminuir la señal del analito observada y, por lo tanto, es difícil de corregir. La técnica de Protein Crash utilizada en la placa P3 es muy eficaz para eliminar proteínas. Funciona desnaturalizando la proteína utilizando metanol o acetonitrilo. La proteína se "precipita" de la solución y forma grandes glóbulos pegajosos. Estos quedan atrapados en un filtro de estructura de poro abierto, debajo del que hay un filtro superhidrofóbico más pequeño que retiene todos los líquidos por encima hasta que se aplica un vacío para forzar el líquido que contiene los analitos de interés a través del filtro y a una placa de recolección a continuación.

El método tradicional de extracción en fase sólida (SPE) utiliza un "sándwich" de sílice muy fino, funcionalizado con hidrocarburos de cadena larga (18 átomos de carbono) entre dos fritas de soporte. La larga cadena de carbono es oleofílica y retarda el paso de los ácidos grasos y proteínas globulares. Sin embargo, las LPL más pequeñas, que son altamente polares debido a un grupo de fosfato ionizado, pasan directamente. La placa SPE necesita pasos adicionales de acondicionamiento y lavado además del paso de carga utilizado en P3. Por lo tanto, es más lento y más dicícil de automatizar.

En la placa experimental desarrollada por PTL, un compuesto adicional, carbonato de lantano, se mezcla con la sílice C18. Las lantánidas se unen fuertemente a los grupos fosfato y la LPL se uniría al lantánido. Sin embargo, sin acceso a equipos sensibles de GC-MS no es posible cuantificar la eficacia del sistema de eliminación de lantánido/fosfato. También es posible que otros compuestos de lantánido puedan usarse con mejor efecto.

 

 

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  Ref. Descripción
  240010 P3 Protein Precipitation Plate High Efficiency (untreated frits) packed individually, rigid shell. 120 & 10um/Vyon HDPE. 96 wells, square, 2 ml volume.
  240100 P3 Protein Precipitation Plate packed individually in a rigid shell. 120 & 10um/Vyon HDPE. 96 wells, square, 2 ml volume.
  240200 P3 Protein Precipitation Plate -Bulk Packed in a bag of 5, no individual shells. 120 & 10um/Vyon HDPE. 96 wells, square, 2 ml volume.

 

REFERENCIAS

Biological sample preparation using solid phase extraction and protein crash techniques in 96 well plates. Porvair Sciences.

Crédito imágenes: Porvair Sciences