La migración celular ocurre durante muchos procesos fisiológicos importantes. Por ejemplo, la migración celular regulada está presente en el desarrollo embrionario, el daño tisular o la cicatrización de heridas. Sin embargo, en muchas situaciones patológicas esta migración está “desregulada”, como en la metástasis del cáncer y la inflamación. Por ello, este proceso se investiga en ensayos sobre la migración condicional y curación de heridas, en la detección de fármacos de alto rendimiento, estudios de interacción celular o ensayos de invasión 2D, entre otros.
Los ensayos de curación de heridas se basan en la observación a lo largo del tiempo del cambio producido en una monocapa de células a las que se les ha realizado una brecha o “herida” (cierre de la herida). El procedimiento es sencillo:
- Se crea una brecha física dentro de una monocapa celular.
- Se supervisa el proceso de migración celular desde las células en el borde de la brecha hasta el cierre de la herida. Para ello, se capturan imágenes de células vivas de manera periódica durante el ensayo.
- Análisis de la tasa de cierre de la brecha. Se determina la velocidad de migración de las células.
Capturas de imágenes de células vivas que muestran el cierre de la brecha de MCF7 células de la herida. Fuente: ibidi
A pesar de la aparente simplicidad de un ensayo de cicatrización de heridas, muchos factores pueden influir en el resultado experimental y deben controlarse. Siguiendo las instrucciones de ibidi, fabricante alemán de todo tipo de productos para ensayos basados en células y microscopía celular, y su guía de aplicación sobre curación de heridas y ensayos de migración se indicarán a continuación los parámetros que se deben estandarizar y controlar para lograr resultados reproducibles y sólidos.
Antes de comenzar el ensayo sobre curación de heridas, ibidi recomienda plantearse las siguientes preguntas:
- ¿Es posible reproducir condiciones de cultivo celular? Dado que muchos factores externos pueden influir en el resultado de un ensayo de cicatrización de heridas, se debe desarrollar por adelantado un enfoque estándar. Todos los procedimientos deben mantenerse constantes durante todo el experimento. Si es posible, deben emplearse los mismos dispositivos, pasos celulares, número de cambios de medio, reactivos y desechables para cada experimento.
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¿Qué recipiente de cultivo se debe usar? Deben tener un fondo delgado (~ 170 µm) que esté optimizado para imágenes de alta resolución de células vivas y microscopía invertida (por ejemplo, el Polymer Coverslip de ibidi). El tamaño del recipiente debe ser suficiente para crear la brecha o herida conveniente. Dependiendo del número de muestras, se pueden utilizar los insertos de cultivo ibidi en el µ-Dish 35 mm o la placa µ-Plate 24. En caso de que no haya necesidad de microscopía de fluorescencia de alta resolución, los insertos de cultivo pueden autoinsertarse en una gran variedad de formatos de cultivos celulares, como placas Petri, cámaras de cultivos celulares y placas de múltiples pocillos.
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¿Qué sustrato se debe utilizar? Depende del tipo de célula y las condiciones experimentales. Un sustrato de tejido tratado que proporciona suficiente adhesión celular, como ofrece el Polymer Coverslip de ibidi, que funciona para la mayoría de los tipos de células. Sin embargo, algunos tipos requieren un recubrimiento especial. Puedes consultar más información en la nota de aplicación de ibidi sobre Cell Culture Coating, en donde se detalla cómo hacer tu propio recubrimiento.
- ¿Es necesario inhibir la proliferación celular? Durante un ensayo de cicatrización de heridas, las células no solo migran hacia la brecha, sino que también proliferan. Esto puede evitarse tratando las células con un inhibidor, como la mitomicina o la actinomicina C, antes de crear la brecha. La dosificación y los controles apropiados deben determinarse por adelantado para que las células no sufran apoptosis ni altener su capacidad de migración debido al fármaco citostático.
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¿Qué densidad celular es ideal? El ensayo debería llevarse a cabo directamente después de que se haya formado una monocapa de células con confluencia óptica. La densidad de siembra de células debe definirse por separado para cada tipo. En condiciones óptimas, las células deberían formar una monocapa 24 horas después de la siembra.
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¿Cómo se crea la brecha? La creación de la brecha es muy importante en los ensayos de curación de heridas, no en vano, existen métodos para crear una “herida” en una monocapa celular: rascar con una punta de aguja o pipeta, colocar un inserto, aplicar un tratamiento químico o electricidad. Encuentre más información acerca de las ventajas y desventajas de los diferentes métodos de creación de huecos aquí.
La capa celular antes (izquierda) y después (derecha) de una herida eléctrica.El círculo marca el área del electrodo, en el que las células están expuestas a electricidad. Fuente: ibidi
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¿Cómo se monitorea el cierre de la brecha? Aunque es posible observar el cierre de la brecha mediante fotografías de diferentes puntos de tiempo, para la mayoría de ensayos, la toma de imágenes de células en vivo es la forma más precisa y conveniente de monitorearlo.
Productos ibidi para ensayos de curación de heridas
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Si deseas ampliar información descarga en PDF la guía de ibidi sobre la realización de ensayos de curación de heridas. También puedes descargal el catálogo completo de ibidi con las diferentes gamas para cultivo celular y microscopía.
Además, ibidi pone a disposición más información detallada para la realización de un ensayo de curación de heridas:
- Application Note 21. Wound Healing Assay with the ibidi Culture-Insert 2 Well in a µ-Dish 35 mm. Descargar la nota de aplicación.
- Application Note 36. Wound Healing Assay with the ibidi Culture-Insert 2 Well in a µ-Plate 24 Weill. Descargar la nota de aplicación.
- Webinar Wound Healing and Migration Assays. Escucha el webinar aquí.
REFERENCIAS
ibidi Application Guide “Wound Healing and Migration Assays”. 2018. ibidi GmbH. Puedes descargar el artículo original completo aquí.
Crédito imágenes: ibidi GmbH
