ENSAYO DE HEMICANALES

Reactivos:

• EGTA 0,5 M (9,5 g EGTA + 2 g NaOH + 30 ml H2O. Ajustar el pH a 7,5 – 8 y el volumen a 50 ml).
• CaCl₂ 0,5 M
• Lucifer Yellow 0,4% (4 mg/ml) en DPBS
• 10% Fetal Bovine Serum (FBS) en DPBS

Experimento:

Estudiar la actividad de los hemicanales celulares a través de la entrada de Lucifer Yellow, de peso molecular 442,3 kDa. Los hemicanales celulares se abren en presencia del CaCl₂. Como control negativo del experimento se realiza el mismo protocolo, pero sin el CaCl₂.

Para poder estudiar la actividad de los hemicanales el cultivo celular debe estar a una confluencia muy baja para que se puedan distinguir células aisladas y así comprobar que el fluoróforo ha entrado por vía de los hemicanales y no por comunicación célula-célula.

Protocolo:

• Lavar las células con 2 mM EGTA en DPBS. Repetir dos veces.
• Incubar las células a 37 C con Lucifer Yellow 0,4% en DPBS durante 30 minutos.
• Lavar las células con 10% FBS, 3,2 mM CaCl₂ en DPBS.
• Ver al microscopio de fluorescencia y óptico. Con luz normal tomar la foto para ver el número de células y su distribución y con fluorescencia identificar donde está el Lucifer Yellow.
  • Alternativamente se puede realizar una contratinción con DAPI como último paso antes de visualizar el experimento (Figura 1).
• Teñir con azul de tripano para comprobar la viabilidad celular. Usar 100 µl de azul de tripano 0,4% en 900 µl de medio de cultivo.

Figura 1: De izquierda a derecha, representación de una imagen de la contratinción con DPAI donde se ven los núcleos celulares teñidos de azul. Siguiente, representación de una imagen de células en las que en Lucifer Yellow ha entrado por vía hemicanales. La tercera imagen representa el solapamiento de las dos anteriores, donde se puede cuantificar células positivas para Lucifer Yellow/células totales.

TÉCNICA DE SCRAPE-LOADING

Reactivos:

• Lucifer Yellow 0,4% (4 mg/ml) en DPBS.
• 10% Fetal Bovine Serum (FBS) en DPBS.

Experimento:

Estudiar la comunicación celular célula-célula mediante el paso de una célula a otra de Lucifer Yellow, el cual entra primeramente en la célula por rotura de esta misma. Las células se rompen, el Lucifer Yellow entra y se va pasando de unas a otras (células que están lejos de la zona de daño) a través de los canales de comunicación célula-célula que hay entre las células.

Protocolo:

• Lavar las células dos veces con DPBS.
• Añadir Lucifer Yellow 0,4% en DPBS y rascar/hacer una raya a lo largo del cultivo celular con una punta de pipeta o bisturí. De este modo, dañaremos las células.
• Incubar las células 3 minutos a 37º.
• Lavas las células con 10% FBS en DPBS.
• Incubar 10 minutos a 37º.
• Ver al microscopio de fluorescencia y óptico. Con luz normal tomar la foto para ver el número de células y su distribución y con fluorescencia identificar donde está el Lucifer Yellow.
  • Alternativamente se puede realizar una tinción simultánea con algún tipo de Dextrano Alexa Fluor que no interfiera con el color del Lucifer Yellow. De este modo, en las células dañadas entrará tanto el Dextrano Alexa Fluor como el Lucifer Yellow, pero el Dextrano Alexa Fluor no podrá pasar de célula a célula por medio de la comunicación célula-célula debido a su gran peso molecular (Figura 2).
• Teñir con azul de tripano para comprobar la viabilidad celular. Usar 100 µl de azul de tripano 0,4% en 900 µl de medio de cultivo.

Figura 2: En la fotografía de la izquierda se muestran células teñidas por Lucifer Yellow. En la fotografía de la derecha, células teñidas con Lucifer Yellow y con Dextrano Alexa Fluor 568.

REFERENCIAS

Fuente: Gago Fuentes, Raquel.

Crédito imágenes: Pixabay / Gago Fuentes, Raquel.