La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una de las técnicas más comunes para analizar mezclas de compuestos orgánicos en laboratorios analíticos de todo el mundo. La HPLC es un proceso complejo que depende de la capacidad de cada molécula para interactuar con la fase móvil que la transporta a través de la columna, la fase sólida que llena las columnas, así como las interacciones entre las diferentes moléculas de la muestra.
Estas interacciones son particularmente importantes en LC/MS (cromatografía de líquidos con espectrometría de masas) cuando las moléculas que se analizan necesitan funcionalidad ionizable. Muchos laboratorios utilizan HPLC de fase inversa (RP-HPLC) donde la fase estacionaria es hidrófoba o no polar y la fase móvil de polaridad moderada. Sin embargo, las columnas de fase inversa pueden contener grupos silanol abiertos, que pueden interactuar con moléculas polares. Esto conduce a una resolución reducida, colas de picos y reducción de la vida útil de la columna.
Añadir modificadores, como el ácido trifluoroacético, acético y fórmico, y las sales de amonio correspondientes, es una práctica bastante habitual porque mejoran la calidad de los análisis de cromatografía RP-HPLC. Estos modificadores ajustan el pH de la fase móvil y permiten al usuario la capacidad de controlar el nivel de ionización de cada molécula.
Los modificadores pueden formar pares de iones con los sitios básicos de Lewis y ácidos de Lewis en las regiones accesibles al solvente en la fase estacionaria. Esto reduce la oportunidad de que los analitos interactúen con estas regiones y da como resultado una mayor longevidad y rendimiento de la columna.
Funciones de los modificadores
SPEX CertiPrep, fabricante de materiales de referencia y estándares analíticos, destaca en su nota técnica “Optimizing your mobile phase: the importance of solvent and buffer” que los modificadores son sustancias puras que cumplen tres criterios:
- No interfieren con la identificación de un componente de una mezcla. Si es posible, se eligen modificadores para facilitar la identificación de estos componentes a medida que se purifican.
- Deben contribuir a resolver dos picos que tienen tiempo de retención casi iguales.
- Solo se necesita una pequeña cantidad de modificador para lograr un objetivo de separación determinado.
Así mismo, también pueden ayudar en la resolución de columnas al interactuar con sitios activos que no están vinculados en la fase estacionaria (inmiscible). Estos sitios abiertos son regiones donde pude haber una posible interacción con los analitos o el ataque de los solventes, lo que provoca degradación de la columna y ensanchamiento de los picos.
También pueden modificar regiones que no son lo suficientemente “pegajosas”. El “efecto de nivelación” de un buen modificador produce más uniformidad en todos los poros de las partículas de la fase estacionaria, así como en todos los espacios entre las partículas, sin causar una degradación de las partículas que se denomina “remodelación” de la fase estacionaria.
Reparar este tipo de defectos en la fase estacionaria significa que no importa dónde se unan los componentes de la mezcle a la fase estacionaria, están exactamente en el mismo entorno, y los componentes se mueven con la fase móvil de manera constante, y se minimizan los residuos.
En la citada nota técnica de SPEX CertiPrep también explican que el resultado de elegir el mejor modificador es que los picos son nítidos con superposiciones mínimas o nulas. Hay varias propiedades químicas que afectan la forma en que los analitos interactúan con las fases móvil y estacionaria. Estos incluyen la polaridad del solvente, así como la miscibilidad de los cosolventes, cuando se usa una fase móvil más complicada. Además, las características de los enlaces de hidrógeno del solvente y los analitos tienen un efecto crítico en la capacidad de una columna para separar cada analito en picos distintos. Para las moléculas polares, particularmente aquellas que pueden ionizarse, también debemos considerar el pKa (acidez) de los analitos y el solvente.
La polaridad ocurre cuando las moléculas o soluciones tienen una diferencia significativa en carga, electronegatividad o enlaces iónicos que conducen a momentos dipolares altos (grandes diferencias en carga). Estos compuestos o disolventes con momentos dipolares altos son polares, a diferencia de los enlaces compartidos por igual (covalentes o covalentes polares) con poca o ninguna carga y no son polares.
La polaridad se puede clasificar usando un índice de polaridad (P’), que es una medida relativa de un solvente o solución con varias matrices polares. Cuanto mayor sea el índice de polaridad, más polar será el disolvente (Tabla 1).
Tabla 1. Índices de polaridad para los solventes más comunes para cromatografía líquida.
| Solvente | Índice de polaridad (P’) |
| Alcanos y ciclohexano | 0.1 |
| Tolueno | 2.4 |
| Diclorometano | 3.1 |
| Isopropanol | 3.9 |
| Tetrahidrofurano | 4 |
| Etanol | 4.3 |
| Acetato de etilo | 4.4 |
| Acetona | 5.1 |
| Metanol | 5.1 |
| Acetonitrilo | 5.8 |
| Agua | 10.2 |
La capacidad de un disolvente o fase móvil para extraer analitos de la fase estacionaria o adsorbente se denomina fuerza eluyente, fuerza de elución o valor eluotrópico (ε0) y depende de la polaridad de las fases cromatográficas. El valor eluotrópico (ε0) expresa la medida de la energía de absorción del solvente o de las móviles con base en un sustrato particular o fase estacionaria como el óxido de aluminio (Tabla 2).
Tabla 2. Fuerza eluyente (fuerza elutrópica) de los solventes más comunes.
| Solvente | Valor elutrópico (ε0) Al2O3 | Modo |
| Alcanos y ciclohexano | < 0.1 | NPLC |
| Tolueno | 0.29 | NPLC |
| Diclorometano | 0.42 | NPLC |
| Tetrahidrofurano | 0.45 | NPLC & RPLC |
| Acetona | 0.56 | NPLC & RPLC |
| Acetato de etilo | 0.58 | NPLC & RPLC |
| Acetonitrilo | 0.65 | RPLC |
| Isopropanol | 0.82 | RPLC |
| Etanol | 0.88 | RPLC |
| Metanol | 0.95 | RPLC |
| Agua | > 1 | RPLC |
*NPLC: normal phase liquid chromatography // RPLC: reversed phase chromatography
Si se usa más de un solvente simultáneamente durante un método o se mezclan las fases móviles, el índice de polaridad cambia. Para determinar la nueva polaridad de una solución, se calcula la composición de la mezcla con los índices de polaridad conocidos de los solventes para obtener un nuevo índice utilizando la siguiente ecuación:
P’AB = ΦAP’A+ΦBP’B
Uso de disolventes y modificadores para aumentar la resolución y la selectividad.
La resolución de picos (la capacidad de una columna para separar picos en un cromatograma) es una interacción compleja de fuerzas y factores que se observan cuando los picos adyacentes se fusionan (coeluyen) en un solo pico o se separan (resuelven) en dos o más picos. La resolución es una función de tres elementos que incluyen la retención, selectividad y eficiencia. El factor de retención o capacidad (K) es el tiempo que un analito de la muestra reside en la fase estacionaria en relación con el tiempo que pasa en la fase móvil. El factor de separación o selectividad (α) es la capacidad de un sistema de cromatografía para distinguir las diferencias químicas entre los compuestos. La eficiencia (N o H) es una medida de platos teóricos en un sistema cromatográfico.
El efecto nivelador de los modificadores: el número pKa o constante de acidez
La selectividad se puede cambiar por efectos químicos al solvente a través de modificadores de fase móvil. La naturaleza química de los analitos cobra importancia a la hora de elegir un modificador. Los modificadores tienen un efecto nivelador que se puede resumir en un número llamado pKa o constante de acidez. Cuanto más alto en el pKa, más débil es el ácido. Los ácidos puros establecen una acidez en el agua relacionada con su pKa; la medida de acidez es paralela al pKa y se llama pH. La escala de pH va de 0 a 14, donde los valores bajos equivalen a compuestos ácidos y los valores altos son alcalinos, siendo el valor 7 considerado como neutro. El pH de una solución indica un ácido o base, pero no necesariamente la verdadera fuerza de ese ácido o base. Para medir la fuerza de un ácido o una base, es necesario observar el pKa. Además de los ácidos, si se disuelve una sal de un ácido débil (ácido con un pKa entre 3 y 7) con el ácido, se tiene un sistema estabilizador del pH llamado tampón. Las sales de ácidos débiles se denominan sales amortiguadoras; al agregar tampones a la fase móvil, el cromatógrafo puede cambiar la resolución (Tabla 3). Se desaconsejan niveles elevados de tampón (>0,1 M) con pH extremo (muy ácido o muy básico) porque pueden dañar las columnas y aumentar la viscosidad de la fase móvil, aumentando así la presión en el sistema. Para analitos básicos o tipos de muestras mixtas, el pH de la fase móvil casi neutral aumenta la retención, mientras que las muestras ácidas se ven favorecidas por la fase móvil ácida.
Tabla 3. Aditivos buffer comunes para HPLC y LC/MS y sus valores pKa y pH correspondientes.
| Buffer | pKa | Rango pH | UV Cutoff (nm) (10 mM) | LC/MS |
| TFA | 0.5 | <1.5 | 210 (0.05%) | Y |
| Fosfato (pK1) | 2.1 | 1.1 – 1.3 | 200 | N |
| Citrato (pK1) | 3.1 | 2.1 – 4.1 | 230 | N |
| Formiato | 3.8 | 2.8 – 4.8 | 210 | Y |
| Acetato | 4.8 | 3.8 – 5.8 | 210 | Y |
| Amoníaco | 9.2 | 8.2 – 10.2 | 200 | Y |
Las diferencias entre el pKa objetivo (o pKb) y el pH y pKa de la fase móvil son aún más importantes en LC/MS) donde la ionización es fundamental para la detección. Mantener el pH y el pKa de la fase móvil (y tampones) similares al objetivo mejora la resolución porque mueve el objetivo ionizable a un estado más neutral, pero para que LC/MS sea efectivo, el compuesto necesita un carácter iónico o tener la capacidad de ionizarse fácilmente. Por lo tanto, la regla general para el pH, el pKa y la fase móvil es apuntar a que el pH de la fase móvil sea de 1 a 2 unidades del pKa de los analitos objetivo dentro del rango de especificación de la columna.
La importancia de los buffer
Es importante recordar que no todos los buffers son apropiados para todas las aplicaciones. Las sales pueden precipitarse fuera de la solución a medida que cambia la composición de la fase móvil. Las sales también son problemáticas para el análisis de LC/MS, ya que pueden inhibir la detección de MS. Si los sólidos se disuelven en la fase móvil, es importante recordar filtrar la fase móvil y, en algunos casos, es posible que sea necesario calentar la fase móvil para disolver los sólidos por completo, en cuyo caso la columna de fase estacionaria también puede tener que mantenerse caliente.
El conjunto de factores que posibilitan una buena separación de una mezcla se denomina “método” de la purificación. Es importante comprender que los primeros cambios durante el desarrollo del método a menudo giran en torno a cambios en la química y la composición de la fase móvil.
Hay muchas opciones diferentes que se pueden hacer con respecto al solvente, la polaridad, los modificadores y las condiciones químicas que pueden influir en la resolución. El mejor enfoque es hacer cambios uno a la vez y trabajar a un ritmo lento y constante para optimizar todos los parámetros de la fase móvil, la fase estacionaria y el sistema para lograr el mejor método para su análisis.
SPEX CertiPrep: modificadores de fase móvil para HPLC y LC/MS de la mayor calidad
SPEX CertipPrep fabrica modificadores de fase móvil de la mayor calidad y que suministra convenientemente empaquetados para un uso sin errores. Las ampollas contienen alícuotas medidas con precisión de modificadores de alta pureza diseñadas para agregarse directamente a la fase móvil para facilitar su uso.
| Modificadores de fase móvil para HPLC y LC/MS | ||||
| Descripción | # CAS | Matriz | Volumen | Referencia |
| Ácido trifluoroacético | 76-05-1 | Puro | 5 x 1 mL | MPK-TFAA-5PK |
| Ácido acético | 64-19-7 | Puro | 5 x 1 mL | MPK-AA-5PK |
| Ácido fórmico | 64-18-6 | Puro | 5 x 1 mL | MPK-FA-5PK |
Para más información puedes consultar los documentos técnicos de SPEX CertiPrep:
- Optimizing your mobile phase: the importance of solvent and buffer.
- Mobile Phase Modifiers for HPLC and LC/MS.
REFERENCIAS
Patricia L. Atkins y Alan H. Katz. Optimizing your mobile phase: the importance of solvent and buffer. SPEX CertiPrep. Recuperado de: https://www.spex.com/getmedia/b60ede75-26ed-48f5-bf86-6d6b83a8fc9a/Optimizing-Your-Mobile-Phase_Importance-of-Solvent-and-Modifier.pdf?ext=.pdf
Mobile Phase Modifiers for HPLC and LC/MS. SPEX CertiPrep. Recuperado de: https://www.spex.com/getmedia/e1ada4cd-daaf-4c00-b1cc-60e4cce86dd2/Mobile-Phase-Modifiers-v2.pdf?ext=.pdf
Imágenes: SPEX CertiPrep
