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Protocolo Western Blot: recomendaciones prácticas

22 de febrero, 2023

Protocolo Western Blot: recomendaciones prácticas

22 de febrero, 2023

Una de las técnicas analíticas más utilizadas en biología celular y molecular es, sin duda, el Western Blot. Se emplea para identificar una proteína específica en una muestra biológica de sangre o tejido. A grandes rasgos, para lograrlo hay que seguir una serie de fases: en la primera, la proteína se separa mediante electroforesis en gel SDS y, posteriormente, se transfiere a un soporte sólido. Por último, se localiza mediante el uso de anticuerpos primarios o secundarios. En este post profundizaremos en esta técnica.

Electroforesis – Imagen de wirestock en Freepik

Tipos de Western Blot

Principalmente hay dos tipos de Western Blot según la técnica con la que se transfieran las proteínas del gel a la membrana. Estas son:

Transferencia semi-seca.
Transferencia húmeda.

La transferencia semi-seca se caracteriza por ser más sencilla y rápida. Además, permite transferir varios geles a la vez. Si la proteína de interés tiene un peso molecular bajo existe el riesgo de que haya una sobre-transferencia y la proteína salga de la membrana.

La transferencia húmeda se recomienda para proteínas de alto peso molecular al necesitar más tiempo de transferencia.

*Types of Western blot results – Image by ErrantScience.com (https://errantscience.com/western-blot-results/)*

Gel

Porcentaje poliacrilamida según el peso molecular de la proteína de interés

% Poliacrilamida	Peso Molecular Proteína
20%	4 – 40 kDa
15%	12 – 45 kDa
12,5%	10 – 70 kDa
10%	15 – 100 kDa
8%	25 – 100 kDa

Gel, protocolo para 10 ml, suficiente para 1 gel de 1,5 mm de grosor o 2 geles de 0,75 mm.

Para Western Blot los geles de 1,5 mm pueden necesitar más tiempo de transferencia dado el grosor, así que mejor usar de 1 mm o 0,75 mm.

Reactivos	Gel separador					Gel concentrado
	Porcentaje Acrilamida
	15%	12,5%	10%	8%	6%
Acr/Bis* 30% T y 2,6% C**	5 ml	4,17 ml	3,33 ml	2,66 ml	2 ml	400 µl
H2O (ml)	2,98	3,78	6,64	5,34	6	2,2
Tris 2 M pH 8,8 (ml)	1,88
Tris 1 M pH 6,8 (µl)						375
SDS 10% (µl)	100					30
PSA 20% (µl)	25					12
TEMED (µl)	12					3

*Mezcla acrilamida/bisacrilamida.

**T = concentración total de monómeros de acrilamida y bisacrilamida // C = concentracion del reticulador.

Los porcentajes de T y C determinan el tamaño del poro en un gel. El tamaño del poro disminuye a medida que aumenta el porcentaje de T. Cualquier incremento o disminución del porcentaje de C afecta a la velocidad de polimeración, aumentando o disminuyendo respectivamente.

Añadir el PSA (persulfato amónico) y el TEMED (1,2-Bis(dimetilamino)etano) de último, mezclar y verter. Una vez añadidos el gel empieza a polimerizar.

Recomendaciones pre-casted gels

Proteínas de bajo peso molecular, >2,5 kDa		Novex Tricina
Proteínas de alto peso molecular, <500 kDa		NuPAGE Tris-Acetato
Separación de proteínas de un rango amplio de pesos moleculares	Tinción con Coomassie o plata	NuPAGE BisTris Blot Bis Tris Plus Novex TrisGlicina
	Alta sensibilidad para western blot	NuPAGE BisTris Bolt BisTris Plus
	Mantener una alta integridad proteica necesaria en los siguientes experimentos (espectromía de masas)	NuPAGE BisTris Bolt BisTris
	Mantener una alta sensibilización de detección con un volumen grande de la muestra	Bolt BisTris Plus

Buffer/tampones

Buffer/Tampón de Carga*	4 ml 200 mM Triz-HCl pH 6,8 + 1 ml 10% SDS + 5 ml 50% Glicerol + 1 ml 0,1% Azul de Bromofenol + ddH2O hasta 10 ml. Alicuotar 900 µl y añadir 100 µl de Beta-mercaptoetanol antes de usar
Buffer/Tampón Electroforesis, TEF 10X	30,3 g Tris-Bse + 144 g Glicina + 10 g SDS + ddH₂O hasta 1 l
Buffer/Tampón de Equilibrado	40 ml Metanol + 20 ml TT 10X + 140 ml ddH₂O
Buffer/Tampón de Transferencia, TT 10X	58 g Trizma Base + 29 g Glicina + 3,7 g SDS + ddH₂O hasta 1 l
Buffer/Tampón de Lavado, TBS 10x, pH 7,5	12,1 g Tris-Base + 14,6 NaCl + ddH₂O hasta 1 l
Buffer/Tampón Lavado, TTBS**	100 ml TBS + 900 ml ddH2O + 500 µl Tween20
Solución de bloqueo	2,5 g leche en polvo o BSA + 50 ml TTBS
Solución de incubación	2 ml TTBS + 1 ml Solución de bloqueo + Anticuerpo Primario/Secundario

*Para 500 ml de Tris 2M pH: pesar 121,15 g Tris y añadir ddH₂O hasta 500 ml. Ajustar pH con HCl. Para 10 ml de azul de bromofenol: 100 mg de azul de bromofenol + 60 mg Tris-Base, añadir hasta 10 ml de ddH₂O.

** Como alternativa al TTBS se puede utilizar PBS-Tween 20. Mismo porcentaje de Tween20, 0.05%.

En el buffer/tampón de carga, el glicerol se usa para incrementar la densidad de la muestra por lo que facilita su carga en el pocillo del gel. El azul de bromofenol permite ver el frente de la muestra durante su migración por el gel. El beta-mercaptoetanol reduce los puentes disulfuro intra- e inter- moleculares. El SDS desnaturaliza la proteína a la vez que le confiere cargas negativas, por lo que la proteína migrará del polo negativo al positivo.

El porcentaje de metanol en el buffer/tampón de equilibrado varía según el tamaño de la proteína, a menor peso molecular de la proteína mayor porcentaje de metanol (20%) y a mayor peso molecular de la proteína menor porcentaje de metanol (5%) metanol.

Protocolo western blot
- Seleccionar el porcentaje de acrilamida y hacer el gel. Primero verter la parte del gel separadora y una vez polimerizado la parte concentradora, colocando el peine inmediatamente después de verter la solución.
- Preparar la muestra y hervirla con el buffer/tampón de carga durante 10 minutos a 95ºC y mantener en hielo.
- Montar la cubeta de electroforesis con el gel, rellenando con TEF. Cargar las muestras en los pocillos, dejar un pocillo para cargar el marcador de peso molecular. Intentar no utilizar el último pocillo, no suelen correr bien las muestras, mejor añadir solo buffer/tampón de carga. Corren el gel a los voltios/amperaje adecuado.
- Mientras el gel corre, activar la membrana de PVDF en metanol. Metanol durante 5 minutos y ddH2O otros 5 minutos, todo en agitación, repetir dos veces.
  - Las membranas de nitrocelulosa no necesitan ser activadas con metanol, se incuban directamente con el buffer de equilibrado. Para métodos de fluorescencia las membranas de nitrocelulosa tienen menos señal de fondo.
- Dejar la membrana en buffer/tampón equilibrado.
- Una vez acabe el gel de correr, incubarlo con buffer/tampón de equilibrado durante 15 minutos a 4ºC. También la membrana y las esponjas.
- Transferencia semi-seca:
  - Montar sobre el cátodo: esponja + membrana + gel + esponja, intentar que no queden burbujas. Donde haya burbujas no habrá transferencia. Cerrar con el ánodo. De esta forma las proteínas pasarán del gel a la membrana, moviéndose desde el polo negativo al positivo.
- Transferencia húmeda:
  - Montar sobre el cátodo: esponja + membrana + gel + esponja, intentar que no queden burbujas. Rellenar el casete de transferencia, así como la cubeta con TT 1X frío. Transferir a voltaje/amperaje y tiempo adecuado. Nunca más de 23 V.
- Desechar el gel (fijarse que no quede marcador, indicativo de que las proteínas del gel se han transferido a la membrana) e incubar la membrana durante una hora a temperatura ambiente en solución de bloqueo.
  - - Antes de la solución de bloqueo se puede comprobar la transferencia mediante el método de Ponceau o con el reactivo SYPRO Ruby, siempre antes de bloquear la membrana, lavar después de utilizar estas tinciones.
- Lavar la membrana con TTBS, 4 veces durante 5 minutos en agitación.
- Incubar con el anticuerpo primario durante toda la noche a 4ºC o una hora a temperatura ambiente. Siempre en agitación.
  - - Tras la incubación, la solución con el anticuerpo primario se puede recuperar y guardar a -20ºC para volver a utilizarlo.
- Lavar la membrana con TTBS, 4 veces durante 5 minutos en agitación.
- Incubar con el anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente.
  - - Si se usa un anticuerpo primario ya marcado, ya no es necesario la incubación con el anticuerpo secundario.
    - Si el anticuerpo secundario es fluorescente, incubar en oscuridad.
- Lavar la membrana con TTBS, 4 veces durante 5 minutos en agitación.
- Detección:
  - - Método colorimétrico.
    - Fluorescencia.
    - Quimioluminiscencia.
      - No olvidarse de quitarle foto al marcador.
- Secar la membrana colocándolo sobre papel de filtro y una vez seca guardarla.
  - - Para volver a usar esta membrana hay que rehidratarla con TTBS y bloquear antes de incubar con otro anticuerpo. Tener en cuenta los tamaños moleculares de las proteínas. La nueva proteína tiene que tener un tamaño diferente a la proteína con la que ya se ha incubado la membrana.